Více než 20 let čelila mořská biologka Mary Hagedorn zdánlivě nepřekonatelným problémem. Hledala způsob, jak zmrazit a rozmrazit embrya zebrafish.
Geny zebrafish, které jsou důležitým experimentálním zvířetem, se přibližují genům člověka dostatečně blízko na to, aby byly použity k vyšetřování nemocí, jako je svalová dystrofie a melanom. Pokud by bylo možné rozmnožovací materiál snadno zmrazit a rozmrazit, bylo by možné tyto studie snadněji provádět a replikovat, protože vědci by nemuseli řešit plány rozmnožování nebo bojovat proti genetickému unášení.
Problémy přicházejí na způsob, jakým se ryby rozmnožují. Vědci úspěšně mrazili - nebo kryokonzervovali, aby používali technický termín - a odmrazovali životaschopné spermie a vejce od mnoha zvířat po celá desetiletí. Ale rybí vejce se vyvíjejí mimo tělo rodiče, což představuje fyziologické problémy, které se nevyskytují, když pracujete s buňkami skotu nebo dokonce lidmi. Vejce obsahuje živiny, které bude vyvíjející se embryo potřebovat, a také má vlastní brnění, což znamená, že tato vejce jsou velká a často obalená v relativně nepropustné membráně.
Jednoduše řečeno, rybí vejce bývají za běžných okolností příliš velká na to, aby rychle zmrazila nebo rozmrazila. Hagedorn - který pracuje jako výzkumný biolog v Centru pro přežití druhů Smithsonianovy národní zoo a Střediska biologie ochrany přírody - je srovnává s planetami. Savčí vejce jsou obvykle spíše jako drobnější členové naší sluneční soustavy - řekněme: Merkur. Vejce zebrafish je blíže k obři jako Jupiter.
"Pokud nechcete zmrazit tkáň správně, vytvoří se v ní ledové krystaly a oni propíchnou buňky a zničí je, " říká Hagedorn.
Strávila 12 let hledáním řešení a nakonec se vypořádala s novým řešením, které zahrnovalo mikroinjekci „kryoprotektantu“ (v podstatě nemrznoucí směsi) do vajíček, což je technika, která tomuto agentovi umožnila obejít ochrannou membránu. Při správném kalibraci, aby nedošlo k otravě buněk, by tyto ochranné látky mohly pomoci zajistit, aby vejce rovnoměrně vitrifikovalo (vypadalo jako sklo), když bylo namočeno do lázně s tekutým dusíkem.
"Pokud nechcete zmrazit tkáň správně, vytvoří se v ní ledové krystaly a oni propíchnou buňky a zničí je, " říká Mary Hagedornová, která čelila pokusům o zmrazení embryí zebrafish. (Encyklopedie života / Bioimages) I když tento proces mohl účinně uvést rybí embrya do stavu pozastavené animace, zahřívání je zpět je stále problémem. Když se zahřívají, existuje přechodný bod mezi ideálním sklovitým stavem a teplotou místnosti, kde se mohou znovu začít tvořit ledové krystaly. A tyto krystaly mohou poškodit buněčný materiál, takže jej nelze dále rozvíjet.
"Potřebovali jsme je rozmrazit mnohem rychleji, " řekl Hagedorn. „Pomocí nástrojů, které jsme měli v roce 2011. . . Zasáhl jsem zeď. “
Na chvíli se vzdala.
A tak by to mohlo zůstat, kdyby nebylo náhodného setkání na kryokonzervační konferenci někdy v roce 2013, kde zaslechla prezentaci Johna Bischofa, profesora strojního inženýrství na University of Minnesota.
Jak říká Bischof, prezentoval nesouvisející téma týkající se nanočástic oxidu železa, které jeho laboratoř použila při bezpečném opětovném zahřátí lidské tkáně k transplantaci. Jeho výzkum klikl na Hagedorna a přiměl ji, aby přemýšlela o svém potenciálu pro aplikace, které nejsou savci.
"Řekla: Co můžete udělat, abyste mi pomohla s embryi, " vzpomíná Bischof.
Tato počáteční otázka vyvolala komplexní, pokračující interdisciplinární spolupráci - takovou, v níž jak Hagedorn, tak Bischof trvají na významu práce druhého.
Jejich výsledky, zveřejněné tento týden v časopise ACS Nano, naznačují, že by bylo možné přece jen bezpečně znovu ohřát embrya zmrazených ryb.
Inspirací pro jejich práci bylo úsilí nyní zesnulého vědce jménem Peter Mazur, který si myslel, že by bylo možné znovu zahřát zmrazená embrya lasery. (Ano, lasery.) Zatímco myšlenka byla potenciálně zdravá, je to náročné, řekl mi Hagedorn, nechat lasery přenášet teplo do biologického materiálu. Společně s dalším výzkumníkem jménem Fritz Kleinhans však Mazur přišel na to, že by bylo možné do roztoku přidat embryo jinou látku, která by zachytila teplo z laseru a přenesla ho do biologické hmoty.
V případě Mazura to znamenalo saze ve formě indického inkoustu, což je látka, která dobře absorbuje a předává teplo - a ten, který Kleinhans říká, si můžete jednoduše koupit na Amazon.com. Pokud by například bylo umístěno kolem zmrazeného myšího embrya, jediný laserový puls by mohl téměř okamžitě přivést buněčný materiál na pokojovou teplotu, čímž by obešel mezistupeň fáze zahřívání, kde hrozí, že se vytvoří ledové krystaly. Kleinhans říká, že v dřívější fázi Hagedornovy práce doufala, že tato technika bude fungovat i pro embrya zebrafish. Bohužel byli stále příliš velcí a v době, kdy se vnější teplo dostalo do středu, se již tvořily fatální ledové krystaly.
Jak však Hagedorn, Bischof a jejich spolupracovníci píšou ve svém novém příspěvku, existuje i jiná cesta. Šíření indického inkoustu na vnější stranu embrya nemusí stačit, ale co když do něj vloží nějaký jiný materiál reagující před zmrazením? Aby se toho dosáhlo, usadili se na zlatých nanorodech - nepatrných molekulárních strukturách, řádech o velikosti menších než lidské vlasy - které před injekcí do embrya mikroinjekcí spolu s nemrznoucími látkami do embrya využili metod, které Hagedorn pracoval před lety.
Jak vědci píšou ve svém článku, „Tyto nanočástice mohou efektivně generovat teplo, když se laserová vlnová délka shoduje s povrchovou plazmonovou rezonanční energií nanočástic.“ To je složitý způsob, jak říci, že nanorody mohou absorbovat a zesílit energii z krátkého záblesku světla.
Zlato, stejně jako mnoho jiných látek, vykazuje na nanoměřítku odlišné vlastnosti než ve velkém. Dobře zkalibrovaný milisekundový laserový impulz může náhle zahřát embryo prostřednictvím zlata distribuovaného v něm a znovu jej ohřát rychlostí 1, 4 x 107 ° C za minutu, což je téměř nepochopitelná teplota, kterou lze zvládnout v rychlých dávkách, které vědci zaměstnávají.
"V jednom milisekundovém pulzu laseru přecházíte z tekutého dusíku na pokojovou teplotu, " říká Bischof. Je důležité, že na rozdíl od jakékoli metody, kterou se Hagedorn předtím pokusil, byly výsledky dost horké - a dostatečně rozšířené -, aby bylo možné úspěšně znovu zahřát celé embryo zebrafish.
S touto bariérou se nakonec překročily, zůstaly otázky. Klíčem mezi nimi bylo, zda tato embrya budou stále životaschopná. Jak vědci uvádějí ve své práci, významná část byla, i když ne všechna. Z těch, které rozmrazili, se 31 procent podařilo jen hodinu po zahřátí, 17 procent překročilo tříhodinovou značku a pouhých 10 procent se stále rozvíjelo i po 24 hodinové značce.
I když to může znít jako malé, je to mnohem větší než míra přežití v nulovém procentu, kterou přinesly dřívější metody. Hagedorn doufá, že budoucí práce tato čísla „posílí“. A zůstává pozitivní dokonce i na 10 procent. "Ryba může produkovat miliony vajec, a pokud bych měl úspěšně zmrazit 10 procent z nich, je to opravdu dobré číslo, " říká.
Pochopení miliony vajec by samozřejmě vyžadovalo další transformaci procesu z hlediska účinnosti. V tomto bodě spadá velká část této práce na ramena Bischofa a dalších v jeho laboratoři, kde již probíhá práce na zlepšení „propustnosti“ procesu, a potenciálně z něj dělá průmyslové úsilí. "Myslím, že v nadcházejících letech bude existovat řada podpůrných technologií, které se k tomu budou vyvíjet, " řekl mi.
Pokud tato práce uspěje, Hagedorn si myslí, že by mohla mít i jiná využití, která jdou daleko za pokornou zebrafish.
"Spousta chovatelů akvakultury chce zmrazit ryby (reprodukční materiál), protože se třou pouze jednou ročně, " řekla. "Máte na rozmach svých farem tento aspekt rozmachu a vytržení." Pokud byste mohli embrya vyjmout z mrazničky naplánovanějším způsobem, bylo by jídlo levnější a spolehlivější. “
Může mít také dopad na ochranu volně žijících živočichů. Hagedorn, který dnes pracuje především na korálech, si myslí, že by nám to pomohlo opravit poškozené útesy. Také navrhuje, že by to nakonec mohlo obnovit vyčerpané populace žab a možná zachránit i jiné druhy. Bez ohledu na to, kam nás práce v budoucnu vezme, je to však důkaz toho, že dnes existuje vědecká spolupráce.
"Nejprve se to upřímně necítilo skutečné." Dává to biologickému smyslu, že bychom to dokázali, ale zdálo se, že bychom všechny kusy nikdy nedali dohromady, “řekla mi. "Kdybych se na té schůzce nesedl vedle Johna, nikdy bychom to neudělali." Bez našeho společného úsilí - inženýrství a biologie - by se to nestalo. “
